off-target（脱靶）效应是核酸类药物产生毒副作用的一个重要因素，而通过在siRNA药物引导链的种子区中引入GNA从而可以降低单个核苷酸之间的碱基配对的稳定性，以此可以缓解脱靶效应。但GNA/RNA形成是双链中，GNA的碱基普遍采取一种旋转的构象取向从而影响了碱基之间的互补配对，来自Alnylam公司研究人员通过在GNA中引入异核苷isoG和isoC，从而克服了GNA碱基的旋转取向变化带来的对siRNA药物活性的影响，同时降低siRNA药物的脱靶效应。文章发表在Nucleic Acids Research上。

    GNA，结构如下图所示，采用非环状核糖结构，仅包含一个手性中心的三碳主链结构。有趣的是GNA构成同源双链结构较DNA和RNA双链结构具有更好的热稳定性。但在GNA/RNA非同源杂合双链中，G:C含量的增加会降低双链的热稳定性，这与常规DNA/RNA不同，主要原因是在GNA链中，碱基构象的旋转取向（180°，trans-syn）改变了氢键形成进而影响了碱基之间的Watson-Crick互补配对，同时G:C碱基配对也从大沟转到小沟。

既然在双链结构中，GNA的碱基采取的是旋转的构象，可以想象到如果使用isoG和isoC替换GNA中的G和C碱基，是否可以改变GNA中碱基的反Waston-Crick配对，从而改变GNA碱基配对的稳定性。研究人员首先合成GNA-iC和GNA-iG两种亚磷酰胺单体，继而引入到siRNA核酸链中。结果也正如预期一样，使用isoC和isoG确实能够改善GNA/RNA双链的热稳定性。

紧接着研究者对比了异核苷的引入对活性的影响，作者设计了分别靶向hao1（D1-D3）和Ttr基因（D4-D6）的GalNAc-siRNA药物。其中D1和D4为RNA双链，D2和D5为GNA-C/G，D3和D6为GNA-isoG/isoC。使用GNA-C的D2相比较于D1靶基因沉默活性有所降低，但使用GNA-isoC的D3，活性于D1相当。相比较于D4，使用GNA-G的D5活性没有太大的改变，但使用GNA-isoG的D6的沉默活性有一定的增强。

接下来，作者对比了GNA-isoG/isoC的引入对脱靶效应的影响。在0.1， 1， 10 和50 nM四个浓度下，使用GNA-C/G的D2和D5靶向活性没有明显的改变，但随着给药浓度增加，其脱靶效应有明显的改善。使用GNA-isoC的D3的表现和D2类似。但是使用了GNA-isoG的D6在高浓度时相比于GNA-G的D5其CDF迁移增大，但相比较于D4仍有所缓解。

    小鼠体内活性表明使用GNA-C/G后其对靶基因的沉默活性低于RNA双链的亲本，而使用GNA-isoG/isoC的核酸双链对把靶基因的沉默活性优于GNA-C/G，但相比较于RNA双链的亲本活性仍有一定降低。通过对肝脏中引导链的检测发现，其活性和代谢活性有一定的相关性。GNA-C/G的修饰在体内的耐受性低于GNA-isoG/isoC。

     按以往的报道，使用GNA可以降低siRNA药物的脱靶效应，但同时也会影响该类药物的体内活性，而GNA-isoG/isoC异核苷的引入可以扭转碱基的构象取向变化，GNA-siRNA药物的活性得到改善，同时对脱靶效应也有一定的改善。GNA的引入可以使得siRNA种子区的失稳，从而可以通过精细调节单个核苷来优化siRNA药物。

原文地址：https://doi.org/10.1093/nar/gkab916